Veninul de șarpe conține enzime care hidrolizează legăturile carboxil estere.Substraturile pentru hidroliză sunt fosfolipidele, acetilcolina și acetatul aromatic.Aceste enzime includ trei tipuri: fosfolipaza, acetilcolinesteraza și esterază aromatică.Arginina esteraza din veninul de șarpe poate hidroliza și arginina sintetică sau lizina, dar hidrolizează în principal legăturile proteine peptidice din natură, deci aparține proteazei.Enzimele discutate aici acționează numai asupra substraturilor esterice și nu pot acționa asupra vreunei legături peptidice.Dintre aceste enzime, funcțiile biologice ale acetilcolinesterazei și fosfolipazei sunt mai importante și au fost pe deplin studiate.Unele veninuri de șarpe au o activitate puternică de esterază aromatică, care poate hidroliza esterul etilic p-nitrofenil, acetatul de a- sau P-naftalenă și esterul etilic indol.Încă nu se știe dacă această activitate este produsă de o enzimă independentă sau de un efect secundar cunoscut al carboxilesterazei, să nu mai vorbim de semnificația sa biologică.Când veninul de Agkistrodon halys Japonicus a reacţionat cu esterul etilic p-nitrofenil şi esterul etilic indol, hidrolizatele de p-nitrofenol şi fenol indol nu au fost găsite;Dimpotrivă, dacă acești esteri reacționează cu veninul de șarpe din subspecia cobra Zhoushan și veninul de șarpe Bungarus multicinctus, ei vor fi hidrolizați rapid.Se știe că acești veninuri de cobra au o activitate puternică a colinesterazei, care poate fi responsabilă de hidroliza substraturilor de mai sus.De fapt, Mclean et al.(1971) au raportat că multe veninuri de șarpe aparținând familiei Cobra pot hidroliza esterul etilic indol, esterul etilic al naftalinei și esterul butil naftalenic.Acești veninuri de șarpe provin de la: cobra, cobra cu gâtul negru, cobra cu buze negre, cobra aurie, cobra egipteană, cobra rege, cobra mamba aurie, mamba neagră și mamba cu buze albe (D. aw mai cunoaște șarpele cu clopoței cu rombola de est).
Veninul de șarpe poate hidroliza esterul etilic de metil indol, care este substratul pentru determinarea activității colinesterazei în ser, dar acest venin de șarpe nu prezintă activitate de colinesterază.Acest lucru arată că există o esterază necunoscută în veninul de cobra, care este diferită de colinesteraza.Pentru a înțelege natura acestei enzime, este nevoie de muncă suplimentară de separare.
1, fosfolipaza A2
(I) Privire de ansamblu
Fosfolipaza este o enzimă care poate hidroliza gliceril fosfat.Există 5 tipuri de fosfolipaze în natură, și anume fosfolipaza A2 și fosfolipaza
A. , fosfolipaza B, fosfolipaza C și fosfolipaza D. Veninul de șarpe conține în principal fosfolipaza A2 (PLA2), câteva veninuri de șarpe conțin fosfolipaza B, iar alte fosfolipaze se găsesc în principal în țesuturile animale și bacterii.Fig. 3-11-4 prezintă locul de acţiune al acestor fosfolipaze asupra hidrolizei substratului.
Dintre fosfolipaze, PLA2 a fost studiat mai mult.Poate fi cea mai studiată enzimă din veninul de șarpe.Substratul său este legătura esterică pe a doua poziție a Sn-3-glicerofosfatului.Această enzimă se găsește pe scară largă în veninul de șarpe, veninul de albine, veninul de scorpion și țesuturile animale, iar PLA2 este abundent în veninurile de șarpe din patru familii.Deoarece această enzimă sparge globulele roșii și provoacă hemoliză, este numită și „hemolizină”.Unii oameni numesc și lecitinază hemolitică PLA2.
Ludeeke a descoperit pentru prima dată că veninul de șarpe poate produce un compus hemolitic acționând asupra lecitinei prin intermediul enzimelor.Mai târziu, Delezenne et al.a demonstrat că atunci când veninul de cobra acționează asupra serului sau gălbenușului de cal, formează o substanță hemolitică.Acum se știe că PLA2 poate acționa direct asupra fosfolipidelor membranei eritrocitare, distrugând structura membranei eritrocitare și provocând hemoliză directă;De asemenea, poate acționa asupra serului sau a lecitinei adăugate pentru a produce lecitină hemolitică, care acționează asupra globulelor roșii pentru a produce hemoliză indirectă.Deși PLA2 este abundent în cele patru familii de veninuri de șarpe, conținutul de enzime din diferitele veninuri de șarpe este ușor diferit.Șarpe cu clopoței (C
Veninul de șarpe a arătat doar o activitate slabă a PLA2.Tabelul 3-11-11 ilustrează compararea activității PLA2 a 10 veninuri majore de șerpi veninoși din China.
Tabelul 3-11-11 Comparația activităților fosfolipazei VIII a 10 veninuri de șarpe în China
Venin de sarpe
Eliberare de grăsime
acid alifatic,
Cjumol/mg)
Activitate hemolitică CHU50/^ g * ml)
Venin de sarpe
Eliberați acizii grași
(^raol/mg)
Activitate hemolitică „(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
unsprezece
Micracephal ophis
cinci virgulă unu zero
kalyspallas
8. 68
două mii opt sute
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
trei virgulă opt doi
o sută patruzeci
Bnugarus fasctatus
7,56
două sute optzeci
B. multicinctus
unu virgulă nouă șase
două sute optzeci
Viper a russelli
șapte virgulă zero trei
T, mucrosquamats
un virgulă opt cinci
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Separare și purificare
Conținutul de PLA2 în veninul de șarpe este mare și este stabil la încălzire, acid, alcali și denaturant, astfel încât PLA2 este ușor de purificat și separat.Metoda obișnuită este de a efectua mai întâi filtrarea pe gel pe veninul brut, apoi de a efectua cromatografia cu schimb de ioni, iar următorul pas poate fi repetat.Trebuie remarcat faptul că liofilizarea PLA2 după cromatografia cu schimb de ioni nu ar trebui să provoace agregare, deoarece procesul de liofilizare crește adesea puterea ionică în sistem, care este un factor important care provoacă agregarea PLA2.Pe lângă metodele generale de mai sus, au fost adoptate și următoarele metode: ① Wells și colab.② Analogul de substrat al PLA2 a fost utilizat ca ligand pentru cromatografia de afinitate.Acest ligand se poate lega de PLA2 în veninul de șarpe cu Ca2+.EDTA este utilizat în principal ca eluant.După ce Ca2+ este îndepărtat, afinitatea dintre PLA2 și ligand scade și acesta poate fi disociat de ligand.Alții folosesc ca eluent soluție organică 30% sau uree 6mol/L.③ Cromatografia hidrofobă a fost efectuată cu PheiiylSephar0SeCL-4B pentru a îndepărta urmele de PLA2 din cardiotoxină.④ Anticorpul anti PLA2 a fost utilizat ca ligand pentru a efectua cromatografia de afinitate pe PLA2.
Până acum, un număr mare de venin de șarpe PLAZ a fost purificat.Tu și colab.(1977) au enumerat PLA2 purificat din veninul de șarpe înainte de 1975. În ultimii ani, un număr mare de articole despre separarea și purificarea PLA2 au fost raportate în fiecare an.Aici, ne concentrăm pe separarea și purificarea PLA de către oamenii de știință chinezi.
Chen Yuancong și colab.(1981) au separat trei specii de PLA2 din veninul lui Agkistrodon halys Pallas din Zhejiang, care pot fi împărțite în PLA2 acidă, neutră și alcalină în funcție de punctele lor izoelectrice.Conform toxicității sale, PLA2 neutru este mai toxic, care a fost identificat ca neurotoxina presinaptică Agkistrodotoxin.PLA2 alcalin este mai puțin toxic, iar PLA2 acid nu are aproape nicio toxicitate.Wu Xiangfu și colab.(1984) au comparat caracteristicile a trei PLA2, inclusiv greutatea moleculară, compoziția de aminoacizi, N-terminal, punctul izoelectric, stabilitatea termică, activitatea enzimatică, toxicitatea și activitatea hemolitică.Rezultatele au arătat că au greutate moleculară și stabilitate termică similare, dar au avut diferențe semnificative în alte aspecte.În ceea ce privește activitatea enzimatică, activitatea enzimei acide a fost mai mare decât activitatea enzimelor alcaline;Efectul hemolitic al enzimei alcaline asupra hematiilor de șobolan a fost cel mai puternic, urmat de enzima neutră, iar enzima acidă a fost greu hemolizată.Prin urmare, se speculează că efectul hemolitic al PLAZ este legat de încărcarea moleculei PLA2.Zhang Jingkang și colab.(1981) au făcut cristale de Agkistrodotoxină.Tu Guangliang şi colab.(1983) au raportat că un PLA toxic cu un punct izoelectric de 7,6 a fost izolat și purificat din veninul de Vipera rotundus din Fujian și proprietățile sale fizice și chimice, compoziția de aminoacizi și secvența a 22 de reziduuri de aminoacizi la N. -terminal au fost determinate.Li Yuesheng și colab.(1985) au izolat și purificat un alt PLA2 din veninul de Viper rotundus din Fujian.Subunitatea PLA2 * este 13 800, punctul izoelectric este 10,4, iar activitatea specifică este 35/xnioI/miri mg。 Cu lecitină ca substrat, pH-ul optim al enzimei este 8,0 și temperatura optimă este de 65 ° C LD5 injectat intravenos la șoareci.Este de 0,5 ± 0,12 mg/kg.Această enzimă are efecte anticoagulante și hemolitice evidente.Molecula toxică PLA2 constă din 123 de reziduuri din 18 tipuri de aminoacizi.Molecula este bogată în cisteină (14), acid aspartic (14) și glicină (12), dar conține doar o metionină, iar N-terminalul său este reziduu de serină.În comparație cu PLA2 izolat de Tuguang, greutatea moleculară și numărul de reziduuri de aminoacizi ale celor două izoenzime sunt foarte asemănătoare, iar compoziția de aminoacizi este, de asemenea, foarte similară, dar numărul de reziduuri de acid aspartic și prolină este oarecum diferit.Veninul de șarpe cobra rege din Guangxi conține PLA2 bogat.Shu Yuyan și colab.(1989) au izolat o PLA2 din venin, care are o activitate specifică de 3,6 ori mai mare decât veninul original, o greutate moleculară de 13000, o compoziție de 122 de resturi de aminoacizi, un punct izoelectric de 8,9 și o bună stabilitate termică.Din observarea la microscopul electronic a efectului PLA2 de bază asupra globulelor roșii, se poate observa că are un efect evident asupra membranei globulelor roșii umane, dar nu are niciun efect evident asupra globulelor roșii de capră.Acest PLA2 are un efect evident de retardare asupra vitezei electroforetice a celulelor roșii din sânge la oameni, capre, iepuri și cobai.Chen şi colab.Această enzimă poate inhiba agregarea plachetară indusă de ADP, colagen și acid arahidonic de sodiu.Când concentrația de PLA2 este de 10/xg/ml~lOOjug/ml, agregarea trombocitelor este complet inhibată.Dacă trombocitele spălate au fost folosite ca materiale, PLA2 nu ar putea inhiba agregarea la concentrația de 20 Mg/ml.Aspirina este un inhibitor al ciclooxigenazei, care poate inhiba efectul PLA2 asupra trombocitelor.PLA2 poate inhiba agregarea trombocitelor prin hidroliza acidului arahidonic pentru a sintetiza tromboxanul A2.Conformația soluției PLA2 produsă de veninul Agkistrodon halys Pallas din provincia Zhejiang a fost studiată prin intermediul dicroismului circular, fluorescenței și absorbției UV.Rezultatele experimentale au arătat că conformația principală a lanțului acestei enzime a fost similară cu cea a aceluiași tip de enzimă din alte specii și genuri, conformația scheletului a avut o rezistență bună la căldură, iar modificarea structurală în mediul acid a fost reversibilă.Combinația de activator Ca2+ și enzimă nu afectează mediul reziduurilor de triptofan, în timp ce inhibitorul Zn2+ face opusul.Modul în care valoarea pH-ului soluției afectează activitatea enzimei este diferit de reactivii de mai sus.
În procesul de purificare cu PLA2 a veninului de șarpe, un fenomen evident este că un venin de șarpe conține două sau mai multe vârfuri de eluție PLA2.Acest fenomen poate fi explicat astfel: ① datorită existenței izoenzimelor;② Un fel de PLA2 este polimerizat într-o varietate de amestecuri de PLA2 cu diferite greutăți moleculare, dintre care majoritatea sunt în intervalul 9 000 ~ 40 000;③ Combinația dintre PLA2 și alte componente ale veninului de șarpe complică PLA2;④ Deoarece legătura amidă din PLA2 este hidrolizată, sarcina se modifică.① Și ② sunt comune, cu doar câteva excepții, cum ar fi PLA2 în veninul de șarpe CrWa/w
Există două situații: ① și ②.A treia condiție a fost găsită în PLA2 în veninul următorilor șerpi: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, viperă palestiniană, viperă de nisip și șarpe cu clopoței îngrozitor km。
Rezultatul cazului ④ face ca viteza de migrare a PLA2 să se schimbe în timpul electroforezei, dar compoziția aminoacizilor nu se modifică.Peptidele pot fi sparte prin hidroliză, dar în general sunt încă legate între ele prin legături disulfurice.Veninul șarpelui cu clopoței din est conține două forme de PLA2, numite tip a și, respectiv, tip p PLA2.Diferența dintre aceste două tipuri de PLA2 este doar un aminoacid, adică glutamina dintr-o moleculă de PLA2 este înlocuită cu acid glutamic în cealaltă moleculă de PLA2.Deși motivul exact al acestei diferențe nu este clar, se crede în general că este legat de dezaminarea PLA2.Dacă PLA2 din veninul de viperă palestinian este menținut cald cu veninul brut, grupurile terminale din moleculele sale de enzime vor deveni mai multe decât înainte.Din C PLA2 izolat din veninul de șarpe are două N-terminale diferite, iar greutatea sa moleculară este de 30000. Acest fenomen poate fi cauzat de dimerul asimetric al PLA2, care este similar cu dimerul simetric format de PLA2 în veninul șarpelui cu clopoței din est. și șarpele cu clopoței din vest de diamant.Cobra asiatică este compusă din multe subspecii, dintre care unele nu sunt foarte definite în clasificare.De exemplu, ceea ce odinioară se numea subspecia Cobra Caspică exterioară este acum recunoscută
Ar trebui atribuită Cobrei Mării Caspice Exterioare.Deoarece există multe subspecii și sunt amestecate împreună, compoziția veninului de șarpe variază foarte mult din cauza diferitelor surse, iar conținutul de izoenzime PLA2 este, de asemenea, ridicat.De exemplu, veninul de cobra
Cel puțin 9 tipuri de izoenzime PLA2 din speciile r ^ ll au fost găsite în și 7 tipuri de izoenzime PLA2 au fost găsite în veninul subspeciei de cobra Caspic.Durkin şi colab.(1981) au studiat conținutul de PLA2 și numărul de izoenzime din diferite veninuri de șarpe, inclusiv 18 veninuri de cobra, 3 veninuri de mamba, 5 veninuri de viperă, 16 veninuri de șarpe cu clopoței și 3 veninuri de șarpe de mare.În general, activitatea PLA2 a veninului de cobra este mare, cu multe izoenzime.Activitatea PLA2 și izoenzimele veninului de viperă sunt medii.Activitatea PLA2 a veninului de mamba și a veninului de șarpe cu clopoței este foarte scăzută sau nu are activitate PLA2.Activitatea PLA2 a veninului de șarpe de mare este, de asemenea, scăzută.
În ultimii ani, nu a fost raportat că PLA2 în veninul de șarpe există sub formă de dimer activ, cum ar fi șarpele cu clopoței rombofor de est (C. veninul de șarpe conține PLA2 de tip a și tip P, ambele fiind compuse din două subunități identice , și numai dimeraza are
Activitate.Shen şi colab.a propus de asemenea că doar dimerul PLA2 al veninului de șarpe este forma activă a enzimei.Studiul structurii spațiale demonstrează, de asemenea, că PLA2 al șarpelui cu clopoței de vest de diamant există sub formă de dimer.Compus piscivor
Există două PLA ^ Ei și E2 diferite ale veninului de șarpe, în care 仏 există sub formă de dimer, dimerul este activ și monomerul său disociat este inactiv.Lu Yinghua și colab.(1980) au studiat în continuare proprietățile fizice și chimice și cinetica de reacție a lui E. Jayanthi și colab.(1989) au izolat un PLA2 bazic (VRVPL-V) din veninul de viperă.Greutatea moleculară a monomerului PLA2 este de 10000, care are efecte letale, anticoagulante și edem.Enzima poate polimeriza polimeri cu greutăți moleculare diferite în condiția de PH 4,8, iar gradul de polimerizare și greutatea moleculară a polimerilor cresc odată cu creșterea temperaturii.Greutatea moleculară a polimerului generat la 96 ° C este de 53 100, iar activitatea PLA2 a acestui polimer crește cu două
Ora postării: 18-11-2022